Полезная информация

Подписаться на RSS

Популярные теги Все теги

Оптическая микроскопия. Классификация методов.

Методом световой микроскопии возможно изучение различных объетов с увеличением до 2-3 тысяч раз с проведением микрофото- и видеосьемки. Принцип оптической микроскопии был рассмотрен ранее в статье "Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа. Классификация световых микроскопов".

 

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3-4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

 

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

 

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.


Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива - интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

 

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.


Метод светлого поля и его разновидности


Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, дает вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

 

Метод темного поля и его разновидности


Метод тёмного поля в проходящем свете ( Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect), известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Проведение темнопольного исследования. Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

- Устанавливают свет по Келеру;

- Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;

- На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;

- Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;

- Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;

- С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);

- Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла). После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

 

Метод фазового контраста

 

Метод фазового контрастаи его разновидность — т. н. метод «аноптрального» контрастапредназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

 

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

- Набора объективов со специальными фазовым пластинками;

- Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

- Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

 

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

- Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;

- Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");

- Настраивают свет по Келеру;

- Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

- Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

- Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

 

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

 

Поляризационная микроскопия


Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

 

Метод интерференционного контраста

 

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста — они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

 

Метод исследования в свете люминесценции

 

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа. Классификация световых микроскопов.

Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа.

 

Микроскоп (от микро... и греческого  skopeo — смотрю) – это оптический прибор для получения сильно увеличенного изображения изучаемого очень маленького объекта, невидимого невооружённым глазом. При помощи микроскопа можно рассмотреть мелкие детали строения объекта, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, которая характеризуется определённым разрешением. Разрешением оптической системы называется наименьшее расстояние между элементами наблюдаемого объекта, при котором эти элементы ещё могут быть отличены один от другого (под элементами объекта мы понимаем точки или линии).

Если объект удален на так называемое расстояние наилучшего видения, которое составляет250 мм, то для нормального человеческого глаза минимальное разрешение составляет примерно0,1 мм, а у многих людей — около0,2 мм. Примерно это соответствует толщине человеческого волоска. Размеры объектов, таких как растительные и животные клетки, мелкие кристаллы, детали микроструктуры металлов и сплавов и т.п., значительно меньше0,1 мм. Такие объекты принято называть микрообъекты. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопа определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм, т.е. разрешающая способность такого микроскопа составляет около 0,20 мкм или 200 нм.

Когда говорят о разрешающей способности микроскопа, подразумевают, также как и под разрешающей способностью человеческого глаза, раздельное изображение двух близко расположенных объектов. Однако, нужно понимать, что разрешающая способность и увеличение – это не одно и тоже. Например, если при помощи систем визуализации получить со светового микроскопа фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,20 мкм (т.е. менее разрешающей способности микроскопа), то, как бы мы не увеличивали изображение, линии все равно будут сливаться в одну. Т.е. мы сможем получить большое увеличение, но не улучшим его разрешение. Общее увеличение микроскопа равно произведению линейного увеличения объектива на угловое увеличение окуляра. Значения увеличений гравируются на оправах объективов и окуляров. Рассмотрим микроскоп плоского поля (не стереоскопический). Это биологические микроскопы, металлографические, поляризационные. Обычно объективы такого микроскопа имеют увеличения от 4 до 100 крат, а окуляры — от 5 до 16. Поэтому общее увеличение оптического микроскопа лежит в пределах от 20 до 1600 крат. Разумеется, технически возможно разработать и применить в микроскопе объективы и окуляры, которые дадут общее увеличение, значительно превышающее 1600 крат (например, существуют окуляры с увеличением 20 крат, которые в паре с объективом 100 крат дадут увеличение 2000 крат). Однако, обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются самоцелью оптической микроскопии. Назначение микроскопа состоит в том, чтобы обеспечить различение как можно более мелких элементов структуры препарата, т.е. в максимальном использовании разрешающей способности микроскопа. А она имеет предел, обусловленный волновыми свойствами света. Таким образом, различают полезное и неполезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение – это когда можно выявить новые детали строения объекта, а неполезное – это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения объекта.

Еще раз остановимся на понятии разрешающей способности. Разрешающая способность оптических приборов (так же ее называют разрешающая сила) характеризует способность этих приборов давать раздельные изображения двух близких друг к другу точек объекта. Наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображения сливаются, называется линейным или угловым пределом разрешения. Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличений, которые мы получаем с помощью микроскопа. Увеличения до 1250 крат называют полезными, т. к. при них мы различаем все элементы структуры объекта. При этом возможности микроскопа по разрешающей способности исчерпываются. Это увеличение получаем при использовании объектива 100 крат, работающего с масляной иммерсией, и окуляра 12,5 крат (полезное увеличение окуляров лежит от 7,5 до 12,5 крат). При увеличениях свыше 1250 крат не выявляются никакие новые детали структуры препарата. Однако иногда такие увеличения используют — в микрофотографии, при проектировании изображений на экран и в некоторых других случаях.

Когда необходимо существенно более высокое полезное увеличение, используют электронный микроскоп. Этот микроскоп обладает существенно более высокой разрешающей способностью, нежели оптический микроскоп. Электронный микроскоп – это прибор для наблюдения и фотографирования многократно (до 106 раз) увеличенного изображения объектов, в котором вместо световых лучей используются пучки электронов, ускоренных до больших энергий (30—100 кэв и более) в условиях глубокого вакуума.

 

Классификация световых микроскопов и области их применения

 

По строению оптической схемы различают прямые (объективы, насадка и окуляры расположены над объектом) и инвертированные (объект находится над оптической системой, формирующей изображение) микроскопы. Также различают микроскопы плоского поля (дающие двухмерное изображение) и стереоскопические микроскопы (объемное – трехмерное изображение).

По способам освещения разделяют микроскопы проходящего света (изображение формируется светом, проходящим через объект) и отраженного света (изображение формируется светом, отраженным от поверхности объекта).

Микроскопы можно разделить также по методам исследования:

- светлого поля (на светлом фоне выделяется более темный объект);

- темного поля (на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые структуры);

- фазового контраста (на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект);

- люминесценции (на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта);

- поляризованного света (наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта).

 

Можно выделить следующиеобласти применения световых микроскопов:

-Биологические микроскопыдля лабораторных биологических и медицинских исследований прозрачных объектов. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный и люминесцентный свет.

-Стереоскопические микроскопыв лабораториях и на различных производствах для получения увеличенных изображений объектов во время проведения рабочих операций. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля.

-Металлографические микроскопыв научных и промышленных лабораториях для исследования непрозрачных объектов. Работа в отраженном свете. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный свет.

-Поляризационные микроскопыв научных и исследовательских лабораториях для специализированных исследований в поляризованном свете. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля. 

 

Объективы и окуляры для микроскопов

 

Объектив микроскопа - микрообъектив представляет собой сложную оптическую систему, образующую увеличенное изображение объекта, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Микрообъектив создает действительное перевернутое изображение, которое рассматривается через окуляр.

Объективы различаются по оптическим характеристикам и конструкции:

- По степени исправления хроматической аберрации: ахроматы, апохроматы и др. 

- С исправленной кривизной изображения: - планахроматы, планапохроматы. 

- По длине тубуса микроскопа -160 ммдля проходящего света,190 ммдля отраженного света, бесконечность - для проходящего и отраженного света; 

- По свойствам иммерсии: сухие системы (без иммерсии) и иммерсионные системы. 

 

Объективы апохроматы отличаются от ахроматов степенью исправления хроматической аберрации. Благодаря более совершенному устранению дефектов изображения, связанных с хроматической аберрацией, качество изображения, получаемого при наблюдении цветных объектов (окрашенные срезы, микроорганизмы и т.п.), особенно при больших увеличениях, значительно выше при использовании апохроматов. Апохроматы, а также ахроматы большого увеличения применяются совместно с компенсационными окулярами. На оправе апохроматов обычно выгравировано АПО (APO). У ахроматов и апохроматов, особенно большого увеличения, остается неисправленной кривизна поля изображения.

 

При визуальном наблюдении окуляр служит для рассматривания увеличенного изображения предмета, даваемого объективом. В этом случае он выполняет роль лупы. Для нормального человеческого глаза изображение, образованное объективом, совмещается с передне фокальной плоскостью окуляра и тогда лучи выходят из окуляра параллельным пучком, давая изображение предмета на бесконечности. Соответствующей перефокусировкой всего микроскопа можно получить изображение за окуляром на расстоянии наилучшего зрения. Окуляры широко применяются в качестве прокционных систем при микрофотографии, передаче действительного изображения на экран или какой-либо другой приемник изучения.

 

В нашей компании Вы можете приобрести различные виды микрокопов российских и зарубежных производителей, а также аксессуары и дополнительные комплектующие к микроскопам. Для получения более подробной инфомрации по техническим характеристикам и ценам микроскопического оборудования обращайтесь к специалистам компании по тел. (8512) 482-382. 

Конструктор сайтов
Nethouse